ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DO PROMOTOR FRUTO-ESPECÍFICO DO GENE CALTP1 DE COFFEA ARABICA

Abstract

A disponibilidade de promotores endógenos, não patenteados, que regulem a expressão do transgenes de forma limitada espacial e temporalmente é uma valiosa ferramenta para programas de melhoramento. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar o promotor fruto específico do gene CALTP1 (que codifica uma proteína de transferência de lipídeos - LTP) de Coffea arabica. Por meio de análises in silico baseadas nas seqüências do banco de dados do genoma café, foram encontrados 40 Unigenes preferencialmente expressos em fruto que poderiam ser utilizados como sonda na prospecção de seus respectivos promotores. Usando como critérios o nível de expressão e o ineditismo, o gene CALTP1 foi escolhido para a validação experimental por meio das técnicas de Northern blot e RT- qPCR. Os resultados demonstram que esse gene tem expressão preferencial no endosperma dos frutos aos 120 e 180 dias após o florescimento (DAF). O isolamento do promotor desse gene foi feito por meio da estratégia 5’ RACE. Um fragmento de 1.2 kb foi isolado do DNA genômico de C. arabica var. Catuaí amarelo e três fragmentos menores (1.0, 0.78 e 0.4 kb) oriundos de supressões 5’ do fragmento genômico foram produzidos. Esses fragmentos foram clonados em vetores binários e transformados na planta modelo Nicotiana tabacum para análises de expressão envolvendo o gene repórter uidA codificando para a β-glucuronidase (GUS). Os resultados das análises histoquímicas de atividade GUS mostram que os fragmentos de 1.2, 1.0 e 0.78 kb direcionam a expressão para todos os órgãos testados da planta com diferenças no nível de atividade e, todos os três fragmentos promovem expressão baixa ou nula em raízes. Por outro lado, o fragmento menor de 0.4 kb levou a expressão do gene uidA somente nas sementes, tecidos florais e frutos.

The availability of endogenous promoters, unpatented, regulating the expression of transgenes in a limited space and time is a valuable tool for breeding programs. The aim of this work was to isolate and characterize the fruit specific promoter of the CALTP1 gene (which encodes a putative lipid transfer protein) from Coffea arabica. In silico analysis based on sequences of the coffee genome database, 40 Unigenes found preferentially expressed in fruit that could be used as probe in the exploration of their respective promoters. Using as criteria the level of expression and originality, the CALTP1 was chosen for experimental validation by using the techniques of Northern blot and RT- qPCR.The results demonstrate that this gene is expressed preferentially in the endosperm of fruits at 120 and 180 days after flowering (DAF). Isolation of the CALTP1 promoter was made through the 5’ RACE strategy. A fragment of 1.2 kb genomic DNA was isolated from C. arabica cv. ‘Yellow Catuaí’ and three smaller fragments (1.0, 0.78 and0.4 kb) deletions from the 5’ genomic fragment were produced. Theses fragments were cloned into binary vectors and transformed in the model plant Nicotiana tabacum for expression analysis involving the uidA reporter gene coding for the β-glucuronidase (GUS). The results of the histochemistry of GUS activity showed that the fragments of 1.2 kb, 1.0 kb and 0.78 kp direct the expression for all tested plant organs with differences inactivity level, and all three fragments promote low or null expression in roots. On the other hand, the smaller fragment of 0.4 kb led to the expression of the uidA gene only in seeds, fruit and floral buds.