IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CLONES BAC DE COFFEA ARABICA L. HT 832/2 COM MARCAS PARA RESISTÊNCIA À FERRUGEM

Abstract

Bibliotecas BAC (Cromossomo Artificial de Bactéria) têm sido muito utilizadas em mapeamento físico, clonagem posicional, mapeamento comparativo e estudos de evolução de genomas. Visando realizar o mapeamento físico em C. arabica, iniciamos a identificação e caracterização de clones BAC de uma biblioteca de C. arabica hibrido timor 832/2. O híbrido timor, derivado de um cruzamento interespecífico natural provavelmente entre Coffea arabica L. cultivar típica e Coffea canephora, apresenta características de importância agronômica como resistência a diversas raças do fungo biotrófico Hemileia vastatrix. A biblioteca contém 55.000 clones BACs com tamanho médio de 120 Kb. Os clones da biblioteca BAC foram inicialmente agrupados em pools de placa , com 384 clones, e superpools contendo 15 pools de placa o que representa 5760 clones. A identificação de BACs de interesse foi realizada através da seleção por PCR nos superpools e pools, seguida por hibridização em filtros de colônia de bactéria contendo 384 clones. Os superpools e pools de placas submetidos à seleção por PCR utilizaram os primers baseados em AFLPs relacionados com lócus de resistência à ferrugem (BA-48, BA-124). O superpool 07 foi positivo para o marcador BA-48 e os superpools 03, 04, 07 e 08 para o marcador BA-124. Estes superpools foram desmembrados em pools de placa e as placas positivas plotadas em membranas para hibridização com sondas específicas. Os BACs selecionados nas hibridizações foram confirmados através de extração individual do clones, seguida por PCR para verificação da marca de interesse. Até o momento foram identificados 68 clones BACs para o marcador BA-48 e 85 clones para o marcador BA-124. Os BACs selecionados estão sendo parcialmente sequenciados para o mapeamento físico da região contendo lócus de resistência à ferrugem.

BAC libraries (bacterial artificial chromosome) have been extensively used in physical mapping, positional cloning and comparative studies of genomes evolution. With the aim to map physical genomic regions of Coffea arabica, we started the identification and characterization of BAC clones from a C. arabica hybrid timor 832/2 library. Hybrid timor, which is derived from a natural interspecific cross probably between C. arabica L. typical cultivar and C. canephora. The library represents five times the genome of hybrid timor 832/2 C. arabica, which is resistant to most races of the biotrophic fungus Hemileia vastatrix. The library contains 55,000 BAC clones, with the average size of 120 Kb. For BAC identification, pooling of the clones was performed for each 384 well plate. After DNA extraction, the pools were grouped to form 15 super-pools of BAC-DNA each one representing approximately 5760 clones. The superpools and plate pools were selected by PCR using primers for rust resistance markers (BA-48, BA-124). One superpool was positive for BA-48 marker and three for the BA-124. These superpools were separated in plate pools and positive plates were plotted in nylon membranes for hybridization with specific probes. The selected BAC clones were confirmed by PCR of individual clones. Until this moment, 68 and 85 clones for the markers BA-48 and BA-124 were selected, respectively. Those BAC clones are currently being partially sequenced and analyzed to physical map this chromosome region.