Identificação através de genômica funcional de três genes homeobox envolvidos com a resposta ao estresse hídrico em café a partir de dados do Banco Genoma Café

Abstract

Os fatores de transcrição do tipo homeobox em plantas se encontram freqüentemente envolvidos em processos do desenvolvimento. Eles estão divididos em 8 sub-famílias: Zinc-finger homeobox, Bell, Knox, Wushel-like, HD-Zip-I, -II, -III, e –IV, de acordo com a conservação de seqüência e estrutura, dentro e fora do homeodomínio. Estudos recentes demonstraram que esses fatores estão também relacionados com a regulação da resposta ao estresse em plantas. Análises de expressão dos genes Athb -5,-6, -7, -12 (sub-família HD-ZipI) em Arabidopsis thaliana, e do putativo ortólogo em girassol Hahb-4, sugerem que esses genes podem regular o crescimento em resposta ao hormônio ácido abscísico (ABA) em condições de déficit hídrico, e aumentar a tolerância à seca. Neste trabalho, procuramos identificar dentro do banco de dados gerado pelo Programa “Genoma Café” potenciais genes homeobox utilizado métodos filogenéticos para classificá-los dentro dos grupos já bem estabelecidos. Para eleger os genes mais interessantes, diferencialmente expressos em condições de estresse hídrico, foi realizada uma análise in silico de expressão (Northern digital). A partir destas análises, três contigs foram escolhidos para estudos posteriores, sendo renomeados de acordo com o mais similar em A. thaliana: Cahat22, Cahb12 e Cahb1. Os níveis de expressão desses três genes homeobox foram analisados por PCR em tempo real (qPCR) em plantas de Coffea arabica submetidas à condições de déficit hídrico. Os resultados obtidos confirmaram o observado nas análises de Northern digital, e todos os genes homeobox de café apresentaram seu padrão de expressão modulado pela condição de déficit hídrico em folhas, caules e raízes, sendo este padrão diferente para cada gene. Análises de qPCR em distintas regiões da raiz, e experimentos de hibridização in situ, nos permitiram observar o padrão de expressão em diferentes estágios de desenvolvimento, assim como a expressão espacial dos genes Cahb1 e Cahb12: Cahb12 é preferencialmente expresso em raízes laterais e no início da raiz principal, enquanto Cahb1 possui uma expressão mais uniforme ao longo desse órgão. Os dois genes foram reprimidos na porção mais próxima ao meristema apical da raiz. Os resultados dos experimentos de hibridização in situ revelaram que Cahb1 e Cahb12 são expressos exclusivamente no floema das raízes.

Plant transcriptional factors containing homeodomain are frequently involved in developmental processes. They are divided into eight sub-families according to sequence conservation and structure in and outside the homeodomain: Zinc-finger homeobox, Bell, Knox, Wuschel- like, HD-ZipI, -II, -III, e -IV. Recent studies have shown that homeobox genes are also involved in transcriptional regulation of stress response in plants. Expression analysis of Arabidopsis thaliana genes Athb5, -6, - 7, -12 (HD-ZipI sub-family) and the sunflower putative ortologue Hahb-4, suggest that these genes may regulate growth in response to the hormone abscisic acid (ABA) in water deficit conditions and also enhance tolerance to drought. In this work, we searched for potential homeobox genes in the "Genoma Café" Sequencing Project Consortium database, and used phylogenetic methods to classify those among the well-established groups found in A. thaliana. To identify genes differentially expressed and also tissue-specific, we conducted a digital expression analysis. Three contigs with expression patterns apparently influenced by water stress were chosen for further analysis. We renamed these genes based on similarities with A. thaliana genes: Cahat22, Cahb12 and Cahb1. Expression levels of these three homeobox genes were analyzed by real-time PCR (qPCR) in Coffea arabica plants submitted to water deficit. Our results were in agreement with the digital northern data, and all coffee homeobox genes had expression modulated under water deficit conditions in leafs, stems and roots, showing different patterns of expression for each one. The qPCR expression analysis of distinct roots regions and in situ hybridization allowed us to reveal the expression pattern in distinct developmental stages as well spatial localization of Cahb12 and Cahb1 mRNAs: Cahb12 is preferentially expressed in lateral roots, and in the beginning of primary root, while Cahb1 shows conspicuous expression along this organ. Both genes were repressed in the portion of primary root closer to the root apical meristem. The results of in situ hybridization experiments revealed that Cahb12 and Cahb1 are expressed exclusively in root phloem.