Método para análise de comunidades de fungos associadas a frutos e grãos do cafeeiro

Abstract

Material vegetal de qualquer órgão ou tecido abriga um elevado número de microrganismos, principalmente fungos. Esses fungos podem ser patogênicos ou endofíticos, aqueles que não causam efeito visível sobre a planta. Muitas espécies de fungos são capazes de produzir metabólitos, os quais podem alterar a qualidade do produto de origem vegetal. No caso do café, caracterizado por seu aroma e sabor, os fungos supostamente interferem na qualidade e também segurança do produto. Para a avaliar a ocorrência e freqüência desses fungos é preciso recorrer a procedimentos que garantam a detecção e a recuperação dos fungos, a partir de seu substrato, da forma mais completa possível. O fruto cereja do cafeeiro apresenta três partes distintas: a camada externa, constituída pelo exocarpo, a camada intermediária ou mesocarpo, e a parte interna, representada pelo endosperma que dá origem ao café beneficiado. A comunidade de fungos da camada externa ("x") é constituída por todos os organismos presentes no ambiente em que o fruto se desenvolveu ou entrou em contato. Sua determinação é feita pela lavagem da superfície do fruto. O mesocarpo é a parte do fruto localizada entre o exocarpo e o endocarpo e abriga a comunidade intermediária ("m"). A comunidade interna é constituída pelos fungos que habitam o endosperma ou grão do café, sendo a caracterização destes de maior interesse. Este trabalho descreve uma metodologia eficiente para recuperação, isolamento e caracterização de fungos potencialmente toxigênicos em frutos do tipo cereja do café. Os cuidados iniciais incluem uma rigorosa seleção dos frutos do tipo cereja, coletando somente aqueles que apresentem características do fruto maduro, sem sinal de ataque por insetos ou organismos patogênicos e limpos. Esta coleta pode ser feita diretamente na planta ou no terreiro, desde que os frutos tenham sido coletados no dia. Para o estudo da comunidade externa, cinqüenta frutos do tipo cerejas são agitados em 100ml de água peptonada 0,1%, esterilizada, removendo assim a comunidade externa. Em seguida, a suspensão é diluída em série e plaqueada em duplicata em meio DG18 (SAMSON et al., Introduction to food and airborne fungi. Wageningen: CBS, 2000). No levantamento da comunidade do mesocarpo, a superfície das cerejas do procedimento anterior é desinfestada por imersão em NaClO 2% durante 10 minutos, sob agitação constante, e então enxaguadas em água estéril. Para a retirada da casca, os frutos são apertados com a mão e as cascas colocadas diretamente no cadinho, liquidificador ou mixer. Após acréscimo de 50 mL de diluente estéril por 3 minutos, o mesocarpo pectináceo e esmagado até o completo rompimento e a suspensão coada em uma peneira. Segue-se a diluição em série da suspensão e a inoculação em placas de Petri. Para o estudo da comunidade interna, a mucilagem residual é removida dos pergaminhos, agitando os grãos do procedimento anterior em solução NaOH 0,2 N por 10 minutos. Os grãos são enxaguados e secos em papel de filtro para remover água em excesso e então colocados em DG18 com um suave aperto. As placas são incubadas a temperatura ambiente por 7 dias. O número de colônias de fungos presentes nas placas fornecerá os resultados das unidades formadoras de colônia por fruto nas comunidades "x" e "m". No caso da comunidade interna "i", o resultado é dado em porcentagem de grãos infectados. Adaptações na metodologia possibilitam ainda o trabalho com outros tipos de cafés. Estas adaptações devem ser feitas levando em consideração o princípio de separação das comunidades. No caso do café em coco, o fruto deverá ser descascado e as cascas processadas através de diluições em série. No caso, as comunidades externa e intermediária "x + m" são avaliadas em conjunto. Os grãos descascados são plaqueados diretamente após desinfestação superficial com NaClO 1% por 30 segundos, para determinar a comunidade interna "i". A leitura das placas em microscópio estereoscópico permite identificar alguns grupos de fungos e até espécies. No gênero Aspergillus, é possível diferenciar os grupos "niger" e "ochraceus". Dentro do grupo "ochraceus" pode ser diferenciada, pela tonalidade da cor amarela, a espécie Aspergillus sulphureus. Do gênero Penicillium, duas espécies foram diferenciadas, pertencentes ao subgênero "Furcatum" e "Penicillium", respectivamente. As espécies de Fusarium mais comuns em frutos de café, Fusarium stilboides e Fusarium semitectum, também podem ser reconhecidas, bem como Cladosporium cladosporioides. Os protocolos descritos, apesar de apresentarem um custo um pouco mais elevado que o tradicional "blotter test", permitem a detecção e quantificação rápida e confiável de fungos presentes em grãos e frutos de café, principalmente das espécies que oferecem potencialmente risco para a qualidade e a segurança do produto.