Mapeamento físico detalhado do loco Mex-1 com clones BAC em café

Abstract

O nematóide da espécie Meloidogyne exigua parasita o café (Coffea arabica L.) e sua erradicação das regiões infestadas é impraticável. Estudos anteriores mostraram que a resistência a M. exigua é controlado por um gene de herança simples, designado Mex-1 presente na espécie C. canephora. Linhagens de café arábica apresentando resistência têm sido desenvolvidas em alguns programas de melhoramento por meio da introgressão deste gene. O estudo da forma de introgressão do gene Mex-1 de C. canephora em C. arabica, pode dar a oportunidade de melhor entendimento da genética da resistência. Muitos estudos têm demonstrado que bibliotecas BAC são bem apropriadas para a clonagem baseada em mapa e para o mapeamento físico. O desenvolvimento desta biblioteca (BAC) permite acelerar o mapeamento do gene Mex-1. A biblioteca BAC de café foi avaliada com 3 marcadores ligados a Mex-1, obtidas a partir de marcadores AFLP clonados. A partir destes marcadores, Exi-2, Exi-3 e Exi-4, foram identificados 5, 11 e 2 clones positivos, respectivamente. Os 18 clones positivos associados à região Mex-1 foram identificados e isolados. Estes marcadores moleculares flanqueando Mex-1 foram reunidos em 3 regiões de contig. O tamanho dos insertos variou entre 130 e 250 kb. Os clones BAC Exi-2 e Exi-3 foram, respectivamente, separados em 2 contigs homeólogos. Isto é consistente com a estrutura alotetraplóide de C. arabica. Cada contig homeólogo está contido em um dos 2 subgenomas de C. arabica. Além disso, a distinção de apenas 2 contigs homeólogos sugere que o fragmento introgredido levando Mex-1 é o resultado de uma recombinação homóloga entre os genomas de C. canephora e um dos dois subgenomas de C. arabica. Estes clones BAC foram analisados por fingerprinting e seus padrões de bandas foram comparados. O DNA dos clones foi então analisado por hibridação e amplificação com SCAR (Exi-2 e Exi-3) e 9 combinações de primers das extremidades BAC (3A-T7, 3B-T7, 3B-SP6, 3G-T7, 3H-T7, 3K-T7, 4A-T7, 4A-SP6 e 4B-T7) foram também utilizados. Os clones BAC positivos, relativos aos marcadores Exi-2, Exi-3 e Exi-4, foram reunidos em 5 contigs. O primeiro contig aparece composto de dois clones BAC positivos com o marcador Exi-4. O padrão de fingerprinting destes clones mostrou forte semelhança, apresentando também o mesmo perfil RFLP com a sonda 4B-T7. Dos cinco clones BAC identificados com o marcador Exi-2, dois contigs designados Exi-2 I e Exi-2 II foram distintos. O primeiro consiste nos BAC 2B e 2E, enquanto o segundo dos BAC 2A, 2C e 2D. Os clones BAC positivos Exi-3 estão organizados em dois contigs distintos chamados Exi-3 I e Exi-3 II. No total, nove sítios de restrição ou PCR, correspondentes a sete marcadores físicos (seqüências identificadas por hibridação ou PCR) foram localizados na região Exi-3. Baseado nos seis marcadores físicos compartilhados pelos dois contigs, foi observada uma certa colinearidade nestes contigs. Não havia nenhuma diferença discernível na posição dos marcadores entre os dois contigs Exi-3. Apesar disso, os dois contigs homeólogos mostraram diferenças significativas. As três regiões cromossômicas correspondentes ao contig Exi-4, os dois contigs Exi-2 e os dois contigs Exi-3 não apresentaram nenhuma sobreposição. Como esperado para a estrutura alotetraplóide de C. arabica, contigs homeólogos foram identificados. Além disso, a presença dentro da região Mex-1 de clones BAC contendo genes análogos de resistência (RGAs) foi investigado por amplificação, utilizando para isso, primers degenerados e hibridação com sondas RGA de café. Clones BAC positivos foram identificados para várias famílias de RGA. A região Mex-1 parece formar um complexo agrupamento de genes de resistência.