Isolamento e caracterização convencional e molecular por ARDRA e DGGE da microbiota associada ao café despolpado (Coffea arábica L.)

Abstract

Bactérias, leveduras e fungos filamentosos são isolados durante praticamente todas as etapas de processamento do café. Treze amostras de Coffea arabica L. foram coletadas durante as diferentes etapas de processamento do café despolpado de uma fazenda no Sul de Minas Gerais. Os isolados bacterianos e leveduriformes foram identificados por Análise de Restrição de DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA) e análise de sequenciamento da região 16-23S do rDNA (bactérias) e ITS1-5.8S do rDNA (leveduras). Os fungos filamentosos foram identificados através de análises das características macro e microscópicas das colônias. Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) do produto de PCR das regiões rRNA 18S e rRNA 16S foi realizada para analisar as comunidades de leveduras e bactérias. Contagens de bactérias, leveduras e fungos filamentosos foram na ordem de 4,7 x 103 a 1 x 107 UFC/g, 2,3 x 103 a 7,5 x 106 UFC/g, 1 x 102 a 5,5 x 103 UFC/g, respectivamente. Através do ARDRA da região 16-23S do rDNA foram obtidos 16 padrões de fragmentos de restrição distintos correspondentes a 16 espécies distintas de bactérias. Bacillus subtillis, Escherichia coli, Enterobacter agglomerans, Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae foram as bactérias predominantes durante o processamento do café. Lactococcus lactis, Serratia sp., Acinetobacter spp e Bacillus megaterium foram isoladas em meios de cultivo, mas não detectadas por análise de DGGE das mesmas amostras. Todas as espécies detectadas por DGGE foram também isoladas por cultivo, com exceção da bactéria não cultivável. Através do ARDRA da região ITS1-5.8S do rDNA foram obtidos 15 padrões de fragmentos de restrição distintos correspondentes a 14 espécies distintas de leveduras. Pichia anomala foi presente em todas as amostras, com contagens na ordem de 103 a 106 UFC/g. Torulaspora delbrueckii e Rhodotorula mucilaginosa também foram leveduras predominantes durante o processamento do café. Algumas espécies de leveduras como Candida ernobii, C. fukuyamaensis, Pichia caribbica, C. membraniefaciens, Saccharomyces bayanus e Arxula sp. foram isoladas em meios de cultivo, mas não detectadas nas análises de DGGE das mesmas amostras. Todas as espécies de leveduras detectadas por DGGE foram também isoladas por cultivo. Dentre os fungos filamentosos identificados o gênero Aspergillus foi o de maior incidência, seguido pelos gêneros Penicillium sp., Fusarium sp.e Cladosporium. Houve boa correlação entre as espécies encontradas por isolamento em meio de cultivo e sequenciamento e os perfis de DGGE obtidos, tanto para bactérias quanto para leveduras; no entanto as técnicas moleculares precisam estar associadas às técnicas tradicionais a fim de se obter melhor caracterização da microbiota presente.

Bacteria, yeast and filamentous fungi are isolated during all the stages of coffee processing. Thirteen samples of Coffea arabica L. were collected during different processing stages of depulped coffee from a farm in the South of Minas Gerais. The isolated bacteria and yeasts were identified by Amplified Ribossomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) and sequence analysis of the 16-23S of the rDNA (bacteria) and ITS1-5.8S of the rDNA (yeasts). The filamentous fungi were identified by analyses of macro and microscopic characteristics of the colonies. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of the product of PCR of the rRNA 18S and rRNA 16S were carried out to analyze the yeast and bacteria communities. Bacteria, yeast and filamentous fungi counts were in the order of 4.7 x 103 to 1 x 107 CFU/g, 2.3 x 103 to 7.5 x 106 CFU/g, 1 x 102 to 5.5 x 103 CFU/g, respectively. Using the technique ARDRA of the 16-23S region of the rDNA, 16 distinct restriction fragment patterns, corresponding to 16 different bacterial species were obtained. Bacillus subtillis, Escherichia coli, Enterobacter agglomerans, Bacillus cereus and Klebsiella pneumoniae were the predominant bacteria during the coffee processing. Lactococcus lactis, Serratia sp., Acinetobacter spp and Bacillus megaterium were isolated in culture medium, but not detected by DGGE analysis of the same samples. All of the species detected by DGGE were also isolated for cultivation, except for the nonculturable bacteria. The method ARDRA of the ITS1-5.8S region of the rDNA allowed 15 distinct restriction fragment patterns corresponding to 14 different yeast species. Pichia anomala was present in all the samples, with counts to the order of 103 to 106 CFU/g. Torulaspora delbrueckii and Rhodotorula mucilaginosa were also predominant yeasts during the coffee processing. Some yeast species such as Candida ernobii, C. fukuyamaensis, Pichia caribbica, C. membraniefaciens, Saccharomyces bayanus e Arxula sp. were isolated in culture media but not detected in the DGGE analyses of the same samples. All of the yeasts species detected by DGGE were also isolated in the culture media. Among the filamentous fungi identified, the genus Aspergillus was of higher incidence followed the genera Penicillium sp., Fusarium sp. and Cladosporium. There was a good correlation among the species found by isolation in culture medium and sequencing and the DGGE profiles obtained, for bacteria, as well as yeasts, however the molecular techniques need to be associated to the traditional techniques in order to obtain better characterization of the microbiota present in coffee processing.