Avaliação do potencial embriogênico de suspensões celulares de Coffea arabica

Abstract

A suspensão de células embriogênicas (ECS) é iniciada pela inoculação de calos friáveis em meio líquido e sob agitação constante, se mostrando como um sistema de propagação in vitro bastante eficiente para aplicações biotecnológicas. As análises da morfologia das células e a caracterização ultraestrutural, por meio das microscopias fotônica e eletrônica, permitem visualizar a transição das células somáticas para embriogênicas, através das características diferenciadoras entre as células, inferindo se o material possui potencial embriogênico. Além disso, o uso de genes marcadores moleculares estádio-específicos apresenta-se como estratégia para o estudo dos processos da embriogênese somática, permitindo uma melhor compreensão dos aspectos moleculares desses processos de desenvolvimento, além de propiciar a possibilidade de otimização de sistemas e protocolos de embriogênese somática. No capítulo 2, objetivou-se relacionar a estrutura morfológica e ultraestrutural de ECS de Coffea arabica cv. Bourbon com seu potencial embriogênico, através da curva de crescimento e das microscopias fotônica, de varredura e de transmissão. No período analisado, a curva de crescimento da ECS apresentou três fases distintas: lag (0 a 4 dias), exponencial (4 a 20 dias) e desaceleração (20 a 28 dias). Os procedimentos de subcultivos para manutenção e multiplicação das ECS devem ocorrer ao final da fase exponencial ou início da fase de desaceleração, bem como a renovação do meio de cultivo. Dois tipos celulares foram identificados: Tipo 1, apresentou características altamente embriogênicas, tais como: células pequenas com citoplasma denso, ausência de grandes vacúolos, núcleo grande e nucléolos proeminentes e presença de grãos de amido; Tipo 2, apresentou células grandes, dispersas, vacuoladas, com ausência de núcleos, pouca ou nenhuma presença de grãos de amido. A análise por MEV das amostras com quatro dias mostrou a presença de células arredondadas e isodiamétricas, formando os aglomerados celulares e menor frequência de células murchas, além da presença de células em divisão. Nas amostras com 28 dias notou-se a presença de células assimétricas, murchas e rompidas. As análises por MET permitiram visualizar na amostra de 4 dias, células com núcleo e nucléolo proeminente, alta razão núcleo/citoplasma, abundante presença de amiloplastídeos e parede celular com pequenos espaços intercelulares. Nas amostras de 28 dias, a grande presença de vacúolos, alguns ocupando quase que totalmente o citoplasma, grandes espaços intercelulares e ausência de conteúdo celular. No capítulo 3, objetivou-se relacionar a renovação do meio nutritivo com a morfologia das células e a expressão dos genes SERK e BBM de ECS de Coffea arabica cv. Catiguá. Todas as ECS coletadas (30, 45, 60 e 75 dias) possuíam significativos aspectos embriogênicos, exceto aos 75 dias, que também apresentou materiais com características não embriogênicas. Com relação à expressão dos genes marcadores, as análises de expressão sugerem uma relação transiente de indução entre SERK e BBM durante o crescimento da suspensão celular. A renovação quinzenal de 90% do meio de cultura ocasiona um nível de estresse às células, com relação direta na expressão dos genes, ou seja, não permite aos genes sua expressão natural.

Embryogenic cell suspension (SCE) is initiated by the inoculation of friable calluses in a liquid medium and under constant agitation, showing to be an in vitro propagation system efficient for biotechnological applications. Cell morphology analyses and the ultra-structural characterization, by means of photon and electronic microscopy, allows the visualization of the transition of somatic cells into embryogenic cells through the differentiating characteristics between the cells, inferring if the material possesses embryogenic potential. In addition, the use of stage-specific molecule marking genes is presented as a strategy for studying somatic embryogenesis process, allowing a better understanding of the molecular aspects of these development processes, besides providing the possibility of optimizing the systems and protocols of somatic embryogenesis. In chapter 2, the objective was to relate morphological and ultra-structural structure of Coffea arabica cv. Bourbon SCE with its embryogenic potential, through the growth curve the photonic microscopies, scanning and transmission. In the analyzed period, SCE growth curve presented three distinct phases: lag (0 to 4 days), exponential (4 to 20 days) and deceleration (20 to 28 days). The procedures of SCE maintenance and multiplication subcultures, as well as the renovation of the culture medium, must occur at the end of the exponential phase or at the beginning of the deceleration phase. Two cell types were identified: Type 1 – presented highly embryogenic characteristics, such as small cells with a dense cytoplasm, absence of large vacuoles, large nucleus and prominent nucleolus and presence of starch grains; Type 2 – presented large, disperse cells, with the presence of vacuoles, absence of nucleus, little or no starch grain. Analyses by scanning electronic microscopy of samples with 4 days showed the presence of rounded and isodiametric cells, forming the cell agglomerates, and the smaller frequency of wilted cells, in addition to the presence of dividing cells. In the samples with 28 days, the presence of asymmetric, wilted and ruptured cells. The analyses by transmission electronic microscopy allowed the visualization, in the 4 day sample, of cells with prominent nucleus and nucleolus, high nucleus/cytoplasm ratio, elevated presence of amyl-plastids and cell wall with small intercellular spaces. In the samples with 28 days, the large presence of vacuoles, some almost occupying the entirety of the cytoplasm, large intercellular spaces and the absence of cellular content were observed. In chapter 3, the objective was to relate the renovation of the nutritive medium to the morphology of the cells and the expression of Coffea arabica cv. Catigua SCE genes SERK and BBM. All the collected SCE (30, 45, 60 and 75 days) possessed significant embryogenic aspects, except at 75 days, which also presented materials with non embryogenic characteristics. Regarding the expression of the marker genes, the expression analyses suggest a transient relation of induction between SERK and BBM during the growth of the cellular suspension. The fortnightly renovation of 90% of the culture medium causes a level of stress to the cells, with a direct relation to gene expression, that is, it does not allow the natural expression of the genes.