Infecção de folhas de cafeeiro por Cercospora coffeicola, identificação de genes para produção e auto-resistência à cercosporina e progresso da cercosporiose em sistemas de cultivo orgânico e convencional.

Abstract

Dentre as doenças do cafeeiro, a cercosporiose, causada por Cercospora coffeicola, vem assumindo importância crescente ao longo dos anos. Em vista da importância e da escassez de conhecimento sobre a doença, objetivou-se: i- estudar o processo de infecção de C. coffeicola em folhas ; ii- identificar se os genes associados à produção da cercosporina e auto-resistência em outras espécies de Cercospora ocorrem em C. coffeicola; iii- o progresso da cercosporiose em lavouras orgânica sombreada (LOS), orgânica (LO) e convencional (LC). Para estudar o processo de infecção, inoculou-se suspensão de conídios de C. coffeicola nas faces adaxial e abaxial de folhas de cafeeiros, e se coletaram amostras após 4 a 168 h e ao 35o dia da inoculação. Observou-se tropismo dos tubos germinativos em direção aos estômatos, onde ocorreram tentativas de penetração. Não se observou a formação de apressórios. Após a penetração, C. coffeicola colonizou o parênquima lacunoso inter e intracelularmente. A esporulação ocorreu através dos estômatos e ao redor deles. Para identificar os genes associados à produção de cercosporina, avaliaram-se seis isolados provenientes de lavouras orgânicas e convencionais de cafeeiros do Estado de Minas Gerais, quanto à produção da toxina in vitro. Selecionou-se o isolado de maior produção para identificar genes homólogos a CTB1 e a ATR1, descritos em C. nicotianae como associados à produção e sensibilidade a cercosporina, respectivamente. Os genes ATR1 e CTB1 de C. coffeicola foram amplificados com primers específicos e não específicos, sequenciados e comparados às sequências de C. nicotianae disponíveis no GenBank. Adicionalmente, obteve-se a construção de GFP e a disrupção de CTB1 em C. coffeicola. Avaliou-se a esporulação e o crescimento micelial dos isolados mutantes, não produtores de cercosporina, em meio BDA com e sem higromicina. A esporulação e o crescimento micelial variaram entre os isolados, mas os mutantes CTB1 não diferiram significativamente do tipo selvagem. No terceiro objetivo, estudou-se o progresso da cercosporiose em três lavouras comerciais de café, orgânica sombreada (LOS), orgânica (LO) e convencional (LC), situadas em Ervália-MG, de novembro/2004 a outubro/2008. Mensalmente, avaliou-se a incidência, severidade, desfolha e enfolhamento das folhas nos ramos das plantas selecionadas. Em geral, os maiores valores de incidência, severidade, área abaixo da curva de progresso de doença, doença máxima, desfolha e enfolhamento ocorreram nos ramos situados no terço superior e das plantas localizadas na LC. Maiores intensidades da doença, desfolha e enfolhamento ocorreram nos meses compreendidos de maio a julho, julho a setembro e outubro a janeiro, respectivamente. Por meio de análises de séries temporais, com o uso dos modelos de regressão não linear ARMA, foi possível representar a dinâmica da cercosporiose, em todos os anos e lavouras em estudo.

Coffee is considered an important commodity worldwide. Diseases are considered a limiting factor in coffee yield. Cercospora leaf spot, caused by Cercospora coffeicola, is considered a relevant disease in coffee crops. This study aimed at understanding: i- the C. coffeicola infection process on coffee leaf by microscopic analysis; and ii-identify if genes associated with cercosporin production and auto-resistance in other Cercospora spp. were present and had the same functions in C. coffeicola, and generate mutant(s) of C. coffeicola with differential cercosporin production; and iii- the progress of cercospora leaf spot epidemics on three different coffee production systems (organic, organic under shadow, and conventional). To the first aim both adaxial and abaxial leaf surfaces were inoculated with a conidial suspension of C. coffeicola. Samples were collected from 4 to 168 h, and at 35 days after inoculation. Germinated conidia showed positive tropism to stomata where attempted penetrations occurred. Appressoria were not observed. After penetration, C. coffeicola colonized the lacunous parenchyma both inter and intracellularly. Sporulation occurred through or around the stomata. To achieve the second aim, six C. coffeicola isolates from Brazilian fields representing organic and conventional production systems in the Minas Gerais state were evaluated for their ability to produce cercosporin in vitro. The highest producing isolate was selected to identify homologs of a polyketide synthase (CTB1) and ABC transporter (ATR1) genes involved in production and sensitivity to cercosporin in C. nicotianae, respectively. The C. coffeicola CTB1 and ATR1 genes were amplified using degenerate and standard PCR primers. These genes were sequenced and compared to C. nicotianae sequences available on GenBank. In addition, C. coffeicola was successfully transformed with a GFP construct and with a CTB1 disruption. Growth and sporulation of these disrupted strains were determined on PDA and PDA supplemented with hygromycin. The sporulation and growth were variable among isolates, and disrupted strains unable to produce cercosporin did not differ significantly from the wild type for either growth or sporulation. To achieve the i third aim, during 4 years (November/2004 – October/2008) the severity (SEV), incidence (INC), leaf fall (LF) and leaf growth (LG), were evaluated to understanding the cercospora leaf spot epidemic progress on three different coffee production systems: organic (LO), organic under shadow (LOS) and conventional (LC), at Ervália-MG, Brazil. The higher SEV, INC, LF, GL, area under disease progress curve, and maximum disease occurred under LC and upper branches. However, the opposite results occurred under LOS and lower branches. The period of greater disease intensity, LF, and GL were the months between May-July, July-September and October-January, respectively. The ARMA model from time series analysis was able to describe the cercospora leaf spot progress during all the years studied and the production systems evaluated.