Levantamento populacional do nematoide das galhas em cafeeiros do Cerrado mineiro e diagnose de Meloidogyne exigua por meio de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP)

Abstract

O nematoide das galhas (Meloidogyne spp.) parasita as principais culturas agricolas, incluindo o cafeeiro. O ataque de nematoide das galhas ao cafeeiro causa prejuizos à cadeia produtiva do café e para o controle eficiente deste fitopatógeno é importante ressaltar algumas medidas, como o levantamento populacional por regiões, afim de evitar a introdução do patógeno na lavoura, e a correta identificação da espécie. Visando tais medidas, abordou-se neste trabalho o levantamento populacional do nematoide das galhas na região produtora de café do Cerrado mineiro, e o estabelecimento de um ensaio para a utilização da amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) a fim de identificar M. exigua. No Capítulo 1, abordou-se levantamento populacional do nematoide das galhas no Cerrado mineiro. Após a coleta, as amostras foram identificadas utilizando eletroforese de isoenzimas, reação em cadeia da polimerase, observação dos padrões perineais da fêmea e da morfologia do macho. Após o levantamento, a espécie mais encontrada foi M. exigua, seguida de M. paranaensis e M. incognita. Também foi diagnosticado em uma amostra M. arenaria. No Capítulo 2, foi realizada uma revisão sobre a utilização da LAMP na identificação de fitonematoides, discutindo detalhes da técnica e seu potencial para diagnose desses patógenos. No Capítulo 3 estabelecemos um ensaio LAMP para a identificação de M. exigua, com primers baseados na região 28S do rDNA do patógeno, sendo monitorada em gel de eletroforese e a olho nu por colorimetria, utilizando o mastermix WarmStant?. A reação proposta foi capaz de amplificar especificamente DNA de M. exigua, não amplificando de M. incognita e M. paranaensis. Além disso, o ensaio LAMP foi altamente sensível, amplificando 0,0026 ng de DNA alvo. Palavras-chave: Identificação. Isoenzimas. Medidas. Patógeno.

The root-knot nematode (Meloidogyne spp.) parasitizes the main cultivated crops, including coffee. The attack of the root-knot nematode on coffee plants causes losses to the coffee production chain, and for the efficient control of this plant pathogen it is important to emphasize some measures, such as the population survey by regions in order to avoid the introduction of the pathogen in the crop, and the correct identification of the species. Thus, was approached in this work the population survey of the root- knot nematode in the coffee producing region of the Cerrado Mineiro, and the establishment of an assay using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in order to identify M. exigua. In Chapter 1, was addressed the population survey of the root-knot nematode in the Cerrado of Minas Gerais. After collection, samples were identified using isoenzyme electrophoresis, polymerase chain reaction, observation of female perineal patterns and male morphology. After the survey, the most found species was M. exigua, followed by M. paranaensis and M. incognita. Melodiogyne arenaria was also diagnosed in a sample. In Chapter 2, a review was carried out on the use of LAMP in the identification of nematodes, discussing details of the technique and its potential for the diagnostics of these pathogens. In Chapter 3, we established a LAMP assay for the identification of M. exigua, with primers based on the 28S region of the rDNA of the pathogen, being monitored in gel electrophoresis and with the naked eye by colorimetry, using the WarmStart® mastermix. The proposed reaction was able to specifically amplify DNA only from M. exigua, not from M. incognita and M. paranaensis. Furthermore, the LAMP assay was highly sensitive, amplifying 0.0026 ng of target DNA. Keywords: Identification. Isoenzymes. Measurements. Pathogen.