Genômica comparativa e potenciais mecanismos de patogenicidade de Pseudomonas que infectam o cafeeiro em Minas Gerais, Brasil

Abstract

As manchas bacterianas causadas por Pseudomonas syringae pv. garcae (Psgc), P. syringae pv. tabaci (Psta) e Pseudomonas cichorii (Pch) são umas das principais doenças bacterianas que comprometem a produção de café no Brasil. Para entender a diversidade genética e os mecanismos subjacentes à patogenicidade destas espécies/patovares bacterianas, este estudo primeiro (Capítulo 1) demonstrou as suas organizações genômicas, encontrou regiões de sintenia e diferenças nas sequencias, com marcada ocorrência de transposições, deleções/inserções e inversões. Comparação entre os proteomas das espécies/patovares, revelou 581 proteínas exclusivas de Psgc, 834 exclusivas de Psta, 1486 exclusivas de Pch e 3424 comuns entre os três patógenos bacterianos. Análise do pangenoma e árvores filogenéticas, baseadas no conteúdo gênico do pangenoma e SNP do genoma core, determinou que as espécies/patovares bacterianas possuem plasticidade genômica. Mediante análise filogenética baseada em identidade média de nucleotídeos (ANIb) as espécies/patovares foram separadas em distintos clados. Assim, os resultados deste estudo indicaram que as bactérias patogênicas ao cafeeiro apresentam alta diversidade genética. Na segunda parte (Capítulo 2), uma análise comparativa dos sistemas de secreção e efetores do tipo III desses fitopatógenos foi realizada, usando como referencia o cluster de genes hrp/hrc da bactéria modelo P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000). Encontrou-se que os genes hrpA, hrpD, hrpF, hrG, hrcQa e hrpJ de Psgc não possuíram identidade de sequência quando comparados com os genes do cluster de Pst DC3000, enquanto os demais genes identificados possuíram identidade de sequência que variaram de 26 a 98%. Em Psta os genes hrcJ, hrpG, hrcS, hrpP, hrpQ e hrpJ não obtiveram similaridade com os genes do cluster de Pst DC3000, enquanto os demais genes identificados possuíram identidades de sequência que variam de 41 a 94%. Em Pch, poucos genes mostraram identidade de sequência com os genes do cluster de Pst DC3000, variando de 27 a 58%. Comparações entre os pansecretomas do tipo III das diferentes espécies/patovares mostrou que de 46 famílias de efetores identificados em Psgc, as famílias avrB, avrPto, hopY, hopZ, hopAI, hopAU, hopBI, hopAJ, hopH, hopAF, hopBF e 10 possíveis novos efetores foram exclusivos. Em Psta, das 43 famílias de efetores identificados, somente foram exclusivos hopI, hopM, hopQ, hopAB, hopAZ e 13 novos candidatos à efetores. Em Pch, hopA, hopB, hopBN e 10 possíveis novos efetores foram exclusivos. Foi observado que avrE foi a única família de efetores compartilhada entre as três espécies/patovares bacterianas. Assim, os resultados indicam que o efetor avrE pode possuir papel fundamental nas interações dessas bactérias com o cafeeiro, e a descoberta de novos efetores pode ajudar a entender como cada espécie/patovar se adaptou ao hospedeiro. Por último (Capítulo 3) pretendendo encontrar os mecanismos de adaptação comuns entre as Pseudomonas patogênicas ao cafeeiro, identificou-se as proteínas secretadas pelo sistema de secreção do tipo II (T2SS) e potenciais efetores do tipo II (T2SE). Foi identificada a presença de 368 proteínas não redundantes que possuíram sinal de secreção de tipo II e ausência de domínio transmembranar em Psgc, 420 em Psta e 459 em Pch. Comparando os três pansecretomas do T2SS, foi observado que 240 proteínas estiveram presentes em todas as espécies/patovares analisadas. No entanto, muitas proteínas tiveram anotações relacionadas com funções associadas a membranas, pilus ou flagelo. Filtragem das proteínas associadas com essas estruturas bacterianas revelou T2SE candidatos com atividades enzimáticas potenciais, que ainda não têm sido relatadas como importantes para a patogenicidade bacteriana. Este trabalho proporciona resultados que servem como ponto de partida para pesquisas futuras, visando obter conhecimento sobre a diversidade genética e os mecanismos moleculares que conferem a capacidade de causar doença no cafeeiro aos patógenos Psgc, Psta e Pch. Esses resultados podem também ser úteis para desenvolver novas estratégias que visem controlar os patógenos bacterianos que causam manchas foliares em plantas de café no futuro. Palavras-chave: Pseudomonas Pseudomonas syringae pv. tabaci. cichorii. Pseudomonas syringae pv. garcae

Bacterial spots caused by Pseudomonas syringae pv. garcae (Psgc), P. syringae pv. tabaci (Psta) and Pseudomonas cichorii (Pch) are some of the major bacterial diseases that compromise coffee production in Brazil. In order to understand the genetic diversity and the molecular mechanisms underlying the pathogenicity of these bacterial species/pathovars, this study first (Chapter 1) showed their genomic organizations, found syntenic regions and sequence differences, with striking occurrence of transpositions, deletions/insertions and inversions. Comparisons among species/pathovar proteomes, revealed that 581 proteins are exclusive to Psgc, 834 exclusive to Psta, 1486 exclusive to Pch and 3424 common to all three bacterial pathogens. Pangenomic analysis and phylogenetic trees, based on gene content of the pangenome and SNP in the core genome, demonstrated that the species/pathovars exhibit genomic plasticity. Phylogenetic analysis based on average nucleotide identity (ANIb) separated the species/pathovars in different clades. Hence, the results of this study indicated that the bacteria pathogenic to coffee show high genetic diversity. In the second part (Chapter 2), a comparative analysis of the type III secretion system and effectors of these three phytopathogens was conducted using the hrp/hrc gene cluster of the model bacterium P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) as a reference. It was found that genes hrpA, hrpD, hrpF, hrG, hrcQa and hrpJ from Psgc did not show sequence identity when compared with genes of the Pst DC3000 cluster, whereas the rest of the genes identified showed sequence identity varying from 26 to 98%. In Psta, the genes hrcJ, hrpG, hrcS, hrpP, hrpQ and hrpJ did not exhibit sequence similarity with genes of the Pst DC3000 cluster, whereas the other genes identified had sequence identity varying from 41 to 94%. In Pch, only a few genes showed sequence identity with the genes of the Pst DC3000 cluster, varying from 27 to 58%. Comparisons among type III pansecretomes of the different species/pathovars showed that out of 46 effector families identified in Psgc, the families avrB, avrPto, hopY, hopZ, hopAI, hopAU, hopBI, hopAJ, hopH, hopAF, hopBF and 10 potential new effectors were exclusive. In Psta, out of 43 effector families identified, only hopI, hopM, hopQ, hopAB, hopAZ and 13 new potential effector candidates were exclusive. In Pch, hopA, hopB, hopBN and 10 possible new effectors were exclusive. It was observed that avrE was the only effector family shared among the three bacterial species/pathovars. Hence, the results indicate that the avrE effector could play a fundamental role in the interactions of these bacteria with coffee plants, and that the discovery of new effectors could aid in understanding how each species/pathovar adapted to the host. Lastly (Chapter 3), aiming to find common mechanisms of adaptation among the Pseudomonas pathogenic to coffee plants, proteins secreted by the type II secretion system (T2SS) and putative type II effectors (T2SE) were identified. The presence of 368 non-redundant proteins that carried a type II secretion signal and lacked transmembrane domains were identified in Psgc, 420 in Psta and 459 in Pch. Comparing the three T2SS pansecretomes, it was observed that 240 proteins were present in all species/pathovars analyzed. However, many proteins were annotated with functions associated with the membrane, pilus or flagellum. Filtering out proteins associated with these bacterial structures revealed T2SE candidates with putative enzymatic activities that have not yet been reported as important for bacterial pathogenicity. This work provides results that constitute a starting point for future research aimed to obtain knowledge on the genetic diversity and the molecular mechanisms that confer the capacity to cause disease on coffee plants to the pathogens Psgc, Psta and Pch. These results could also be useful to develop novel strategies to control the bacterial pathogens that cause foliar spots on coffee plants in the future. Keywords: Pseudomonas cichorii. Pseudomonas syringae pv. garcae. Pseudomonas syringae pv. tabaci