Molecular mechanisms in the first step of ABA-mediated response in Coffea ssp

Abstract

O ácido abscísico (ABA) é um fitohormônio universalmente conservado entre as plantas o qual coordena vários aspectos de resposta ao déficit hídrico, tais como, arquitetura radicular, dormência de sementes e regulação do fechamento estomático. Um mecanismo de transdução de sinal de ABA foi proposto envolvendo os receptores intracelulares de ABA (PYR/PYL/RCARs) que interagem com as fosfatases PP2Cs e proteínas quinases SnRK2. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar pela primeira vez os genes ortólogos desse sistema tripartite em Coffea. Sequências proteicas de Arabidopsis, citros, arroz, uva, tomate e batata foram escolhidas como query para buscar genes ortólogos no Coffee Genome Hub (http://coffee- genome.org/). A expressão diferencial em folhas, sementes, raízes e órgãos florais foi verificada por meio de análises in silico. As análises de expressão gênica in vivo foram também realizadas por RT-qPCR em folhas e raízes de clones de C. canephora (Cc) tolerantes (D T 14, 73 e 120) e suscetíveis (D S 22) à seca os quais foram submetidos ou não ao déficit hídrico. Os perfis de expressão desses genes foram também analisados em folhas de plantas de Ca e Cc crescidas em condição hidropônica e submetidas à tratamento com ABA exógeno (500 μM). Essa abordagem permitiu a identificação e a caracterização de 24 genes candidatos (9 PYL/RCARs, 6 PP2Cs e 9 SnRK2s) no genoma de Cc. Os motivos proteicos identificados permitiram caracterizar os respectivos genes como membros das famílias de receptores PYL/RCARs, fosfatases PP2Cs e quinases SnRK2 da via de resposta ABA- dependente. Essas famílias foram funcionalmente anotadas no genoma de Cc. Análises in vivo revelaram que oito genes foram super expressos em condição de seca em tecidos foliares e radiculares. Entre eles, três genes que codificam fosfatases foram expressos em todos (D T e D S ) clones, consequentemente sugerindo que esses genes foram ativados como uma resposta geral para lidar com o déficit hídrico. Entretanto, dois outros genes que codificam fosfatases foram super expressos somente nos clones D T , sugerindo que eles constituem genes-chave para a tolerância a seca nesses clones. Os clones D T também apresentaram perfil de expressão gênica diferencial para cinco outros genes e desse modo reforçam a ideia de que múltiplos mecanismos biológicos estão envolvidos na tolerância a seca em Cc. Em resposta a ABA exógeno, 17 genes foram expressos em folhas de plantas de Cc e Ca. Muitos genes foram diferencialmente expressos no clone 14 D T tanto em condição controle como após 24h de tratamento com ABA. Em condição controle, cinco genes foram mais expressos tanto nas plantas D T de Cc como de Ca. A quinase CcSnRK2.6 se destacou por ser expresso somente nas plantas de Cc (D T e D S ) após 72h de tratamento com ABA. De forma geral, foi observado que a via de sinalização de ABA é atrasada nos Ca var Rubi D S . Tais evidências moleculares corroboram com as análises microscópicas que mostram que o clone 14 D T foi mais eficiente para controlar o fechamento estomático em resposta ao tratamento com ABA do que as outras plantas de café. Todas essas evidências irão nos ajudar a identificar o determinismo genético para a tolerância à seca por meio da via ABA-dependente essencial para obter marcadores moleculares que podem ser usados em programas de melhoramento.

Abscisic acid (ABA) is a phytohormone universally conserved in land plants which coordinates several aspects of the plant response to water deficit such as root architecture, seed dormancy and regulation of stomatal closure. A mechanism of ABA signal transduction has been proposed, evolving intracellular ABA receptors (PYR/PYL/RCARs) interacting with PP2Cs phosphatases and SnRK2 protein kinases. The goal of this study was to identify and characterize for the first time the orthologs genes of this tripartite system in Coffea. For this purpose, protein sequences from Arabidopsis, citrus, rice, grape, tomato and potato were chosen as query to search orthologous genes in the Coffee Genome Hub (http://coffee-genome.org/). Differential expression in tissues as leaves, seeds, roots and floral organs was checked through in silico analyses. In vivo gene expression analyses were also performed by RT-qPCR in leaves and roots of drought-tolerant (D T 14, 73 and 120) and drought-susceptible (D S 22) C. canephora Conilon clones submitted (or not) to drought. The expression profiles of the tripartite system CcPYL-PP2C-SnRK2 genes were also analyzed in leaves of C. arabica (Ca) and C. canephora (Cc) plants grown under hydroponic condition and submitted to ABA exogenous treatment (500 μM). This approach allowed the identification and characterization of 24 candidate genes (9 PYL/RCARs, 6 PP2Cs and 9 SnRK2s) in Cc genome. The protein motifs identified in predict coffee sequences enabled characterize these genes as family’s members of PYL/RCARs receptors, PP2Cs phosphatases or SnRK2 kinases of the ABA-dependent response pathway. These families were functionally annotated in the Cc genome. In vivo analyses revealed that eight genes were up-regulated under drought conditions in both leaves and roots tissues. Among them, three genes coding phosphatases were expressed in all (D T and D S ) clones therefore suggesting that they were activated as a general response to cope with drought stress. However, two other phosphatase coding genes were up- regulated only in the D T clones, suggesting that they constitute key-genes for drought tolerance in these clones. The D T clones also showed differential gene expression profiles for five other genes thus reinforcing the idea that multiple biological mechanisms are involved in drought tolerance in Cc. In response to exogenous ABA, 17 genes were expressed in leaves of Cc and Ca plants. Several genes were differentially expressed in the D T clone 14 either in control condition or after 24h with ABA treatment. Under control condition, five genes were higher expressed as in the Cc as in Ca D T plants. The kinase CcSnRK2.6 was highlighted as gene specifically expressed in the Cc plants (D T and D S ) after 72h of ABA treatment. Overall, it was observed that ABA signaling pathway is delayed in the D S C. arabica Rubi. Those molecular evidences corroborated with microscopies analyses which showed that the D T clone 14 was more efficient to control the stomatal closure than other coffee plants in response to ABA treatment. All these evidences will help us to identify the genetic determinism of drought tolerance through ABA pathway essential to obtain molecular markers that could be used in coffee breeding programs.